免疫熒光實驗是根據(jù)抗原抗體反應的原理,先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物,再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原(或抗體)。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標本,熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色),可以看見熒光所在的細胞或組織,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,以及利用定量技術測定含量。
免疫熒光實驗技術又稱熒光抗體技術,是標記免疫技術中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。
免疫學的基本反應是抗原-抗體反應。由于抗原抗體反應具有高度的特異性,所以當抗原抗體發(fā)生反應時,只要知道其中的一個因素,就可以查出另一個因素。免疫熒光技術就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體(或抗原)上,與其相應的抗原(或抗體)結(jié)合后,在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應。
直接法:
將標記的特異性熒光抗體,直接加在抗原標本上,經(jīng)一定的溫度和時間的染色,用水洗去未參加反應的多余熒光抗體,室溫下干燥后封片、鏡檢。
間接法:
如檢查未知抗原,先用已知未標記的特異抗體(第一抗體)與抗原標本進行反應,用水洗去未反應的抗體,再用標記的抗抗體(第二抗體)與抗原標本反應,使之形成抗體-抗原-抗體復合物,再用水洗去未反應的標記抗體,干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體,則表明抗原標本是已知的,待檢血清為第一抗體,其它步驟的抗原檢查相同。
標記的抗抗體是抗球蛋白抗體,同于血清球蛋白有種的特異性,如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應,因此,制備標記抗體適用于任何抗原的診斷。